阪崎腸桿菌（Enterobactersakazaii）是奶粉（乳）制品中新發(fā)現的一種致病菌。由其引發(fā)的嬰兒、早產(chǎn)兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結腸炎散發(fā)和暴發(fā)的病例已在全球相繼出現。本公司自主研制的阪崎腸桿菌活菌熒光PCR檢測試劑盒能快速檢測出奶粉（乳）制品中存在的阪崎腸桿菌菌屬，且相比DNA-PCR的檢測方法，本檢測方法可以區分死菌和活菌，因此不需要進(jìn)行再次驗證。 本試劑盒通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應對奶粉（乳）制品中的阪崎腸桿菌進(jìn)行定性檢測，靈敏度高，特異性強， 能快速檢測出奶粉（乳）制品中的阪崎腸桿菌。

產(chǎn)品規格

 40次/盒

主要成分

儲存條件

 本試劑盒保存于-20℃，有效期12 個(gè)月。

檢測步驟

1.樣本處理

取100g(ml)樣品，加入900ml的無(wú)菌蒸餾水，震蕩溶解，與 37度培養15h左右。移取1ml 轉入 10ml改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯中，37度震蕩培養約6h 。

2.樣本RNA提取

取1.5ml增菌液，采用商品化的細菌RNA提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明提取樣本 RNA。采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA 待用。

3.試劑準備

冰上解凍反應試劑，反應液保持避光，解凍后將反應液混勻并簡(jiǎn)短離心，按每管15ul的量分裝至PCR管中。

4.PCR加樣

每管中加入cDNA樣本10ul，蓋好管蓋，簡(jiǎn)短離心，同時(shí)做陽(yáng)性對照，陰性對照和空白對照（以水代替樣本 cDNA）。

5.PCR擴增

將加好的樣品放置在PCR儀中，熒光通道選擇FAM， PCR反應參數見(jiàn)表，使用不同的PCR儀，反應參數可適當調整。

6.結果分析

基線(xiàn)和閾值的設置：基線(xiàn)范圍設置在3-15個(gè)循環(huán)，閾值設置在基線(xiàn)剛好超過(guò)陰性對照擴增曲線(xiàn)的最高點(diǎn)。

質(zhì)量控制：陽(yáng)性對照CT≤30，有S 型擴增曲線(xiàn)；陰性對照無(wú)CT值，擴增曲線(xiàn)為直線(xiàn)；空白對照無(wú)CT值，擴增曲線(xiàn)為直線(xiàn)。若出現任一結果不正常，需重做實(shí)驗。

結果判定

1.檢測樣品無(wú)CT值，曲線(xiàn)為直線(xiàn)或無(wú)S 型擴增曲線(xiàn)，判定結果為陰性。

2.檢測樣品CT≤35，出現S型擴增曲線(xiàn)，判定結果為陽(yáng)性。

3.檢測樣品35﹤CT﹤40并有S型擴增曲線(xiàn)，需適當增加DNA模板量后重新做實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，再次檢測結果CT值仍處于35和40之間，并且有S型擴增曲線(xiàn)，判定結果為陽(yáng)性，否則判定為陰性。

最低檢測限

8cfu/100g(ml)

注意事項

1.初次使用前請仔細閱讀說(shuō)明書(shū)，并嚴格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.實(shí)驗操作要嚴格分區，防止污染。

3.RNA提取時(shí)要使用無(wú)RNA酶的槍頭和管子，防止RNA降解。

4.反應液反復凍融會(huì )降低靈敏度，建議分管保存。

5.本試劑盒僅供定性篩查用。